Biotecnologie di breeding di precisione: analisi delle esperienze in corso

Tutte le cultivar di fragola ora disponibili sul mercato sono state prodotte utilizzando i tradizionali programmi d’incrocio e selezione. Tuttavia, diversi progetti internazionali e nazionali (ad esempio “RoseBreed” negli Stati Uniti; “Horizon2020-Goodberry”, “iPLANTA” e “MED-Berry” in Europa; “Crea-Biotecnologie” e “PRIN-Micromolecole” in Italia) stanno sostenendo l’applicazione delle biotecnologie genomiche di precisione per il miglioramento genetico della fragola. La sequenza completa del genoma della fragola diploide selvatica rimane la conoscenza più avanzata ora disponibile (Shulaev et al., 2011; Edger et al., 2019). Le conoscenze sviluppate dagli studi genomici sono fondamentali per l’individuazione di nuovi strumenti molecolari per l’analisi e la selezione della diversità genetica, nonché per l’identificazione e protezione commerciale delle cultivar mediante ‘fingerprinting’ genetico e, soprattutto, per l’applicazione delle nuove biotecnologie di breeding (NBTs).

Breeding assistito

Il breeding assistito da marcatori (MAB) comprende l’uso di marcatori associati a diversi caratteri, utili per la verifica dell’identità dei cloni, per l’analisi della diversità genetica, nonché la selezione dei parentali d’incrocio assistita da marcatori (MAPS) e la selezione dei semenzali assistita da marcatori molecolari (MASS). Questo approccio rimane di applicazione limitata nella fragola a causa della mancanza di disponibilità di marcatori più facilmente valutabili, strettamente collegati a tratti economicamente importanti.

Attualmente i più noti sono i marcatori associati alla resistenza ad alcuni patogeni che interessano le fragole (es. Phytophthora spp. e Colletotrichum spp.) e anche alla rifiorenza, sebbene non tanto applicabile per il controllo epistatico osservato per quest’ultimo carattere. Infatti, solo l’abbondante disponibilità di marcatori strettamente collegati, affiancati e facili da usare, combinati a costi ridotti per l’estrazione e l’analisi del DNA, può aiutare a rendere il MAB economicamente vantaggioso per i programmi di breeding della fragola; specie complicata anche dalla struttura genetica ottoploide, con elevata eterozigosità, determinata da continui incroci seguiti dalla clonazione (Hancock et al., 2010).

Queste nuove conoscenze saranno comunque di utilità per la definizione di nuovi programmi di miglioramento genetico della fragola in quanto consentiranno di sviluppare (i) il breeding classico per resistenze piramidali già conosciute in diverse linee o varietà avanzate e (ii) l’identificazione di nuovi marcatori legati a caratteri di interesse (in particolare a patogeni) utilizzando approcci innovativi (QTL – “Quantitative Trait Loci” e GWAS – “Genome-Wide Association Study”). L’avviamento dei nuovi programmi di breeding e l’identificazione di nuovi marcatori molecolari consentiranno: i) la completa caratterizzazione del germoplasma di fragola di interesse per i diversi ambienti di coltivazione, in particolare per resistenza ai patogeni, mediante applicazione di metodologie di genomica avanzata; ii) creare nuovo germoplasma per sviluppare cultivar resistenti da rilasciare sul mercato.

New Breeding Technologies (NBTs): cisgenesi e intragenesi

L’ingegneria genetica è stata applicata in fragola dimostrando la capacità di utilizzare questa tecnologia per migliorare i tratti importanti della qualità delle piante e dei frutti di fragola, ma l’accettazione pubblica rimane uno dei principali fattori limitanti di questa tecnologia (Mezzetti, 2009; Limera et al., 2017).

I nuovi strumenti biotecnologici come cisgenesi/intragenesi, “genome editing” (“zinc-finger” e “CRISPR/Cas9”) e silenziamento genico (RNAi) offrono numerosi vantaggi rispetto al breeding tradizionale; infatti, evitano i passaggi più lunghi e impegnativi del breeding tradizionale, dove spesso vengono introdotti insieme alle caratteristiche volute anche tratti indesiderati.

Nella cisgenesi/intragenesi solo geni e loro sequenze regolative della stessa specie o di specie sessualmente compatibili sono utilizzate per migliorare le specie agrarie (Espinoza et al, 2013; Holmes et al. 2013) e i geni marcatori di resistenza ad antibiotici o ad erbicidi vengono sostituiti con geni reporter cisgenici o intragenici (es. il gene MYB, che regola la produzione di antocianine nei tessuti in rigenerazione permettendone la selezione). Questo consente la generazione di piante migliorate solo nei tratti desiderati con sequenze geniche della stessa specie. L’applicazione di queste tecnologie è fortemente condizionata alla conoscenza della funzione dei geni e delle loro sequenze regolative. Anche queste tecniche sono classificate tra quelle identificate dalla direttiva 2001/18/CE come DNA ricombinante, ma offrono rispetto alla transgenesi una maggiore garanzia di sicurezza in quanto le sequenze inserite sono state isolate dalla stessa specie (cisgenesi) o da una specie compatibile (intragenesi) o della stessa famiglia botanica.

Sulla fragola ci sono già alcune evidenze sulla validità di queste tecniche per migliorare diversi caratteri. Ad esempio, il gruppo del prof. Caballero dell’Università di Granada (Spagna) ha recentemente individuato due geni di difesa (FaWRKY1 e FaNPR3.1) che se silenziati in sistemi transgenici conferiscono resistenza ai funghi del genere Colletotrichum. Inoltre, lo stesso gruppo di ricerca ha caratterizzato due promotori (FaDOF2 e FaAAT2) che regolano l’espressione genica durante la maturazione dei frutti. Questo materiale ha un alto potenziale per migliorare la resistenza di fragola a Colletotrichum, Botrytis e Podosphaera e può essere valutato in piante intrageniche che, anche se ancora regolamentate nella direttiva 2001/18 Ce, hanno potenzialmente una maggiore accettabilità rispetto alle piante OGM. Il problema dei marcatori di selezione può essere risolto utilizzando il gene reporter intragenico consistente nell’allele mutato del gene MYB di melo (Malus domestica) identificato dal gruppo di Krens e Schaart dell’Università di Wageningen (Krens et al. 2015). Questi materiali consentono di sviluppare piante di fragola dove l’espressione dei geni di difesa viene indotta solo nei tessuti suscettibili interessati dall’infezione fungina (e.g. frutto) durante la maturazione o durante l’attacco di un patogeno e consente di evitare gli effetti indesiderati (e.g. variazioni fenotipiche e della produzione di una pianta) normalmente associati all’espressione costitutiva di tali geni in tutti i tessuti della pianta stessa.

Altrettanto interessante è il lavoro avviato in collaborazione con il gruppo della dott.ssa Denoyes che ha portato a dimostrare che la sovraespressione del gene della famiglia PEBP clonato in fragola (cisgenico) determina un elevato livello di rifiorenza in piante di fragola unifere (Fig. 1 A, B) (Gaston et al., in preparazione). Nuovi costrutti, anche con marcatore e promotore cisgenico/intragenico, permetteranno di modificare le cultivar unifere di maggior interesse e il loro comportamento come rifiorenti risulterà con elevati standard produttivi e qualitativi che potranno essere di più facile accettazione da parte del consumatore.

NBTs: “gene editing”

Il “gene editing” rende possibile la manipolazione di ogni gene delle piante permettendo integrazioni, delezioni e mutazioni del gene di interesse (Limera et al. 2017). La tecnica CRISPR/Cas9 permette di generare tagli della doppia elica del DNA in un punto ben preciso, generando mutazioni specifiche per i caratteri di interesse; per tale ragione è stata classificata tra le tecniche del DNA ricombinante identificate dalla direttiva 2001/18 Ce. Tuttavia, diversi studi dimostrano anche frequenti imprecisioni (tagli “off-target”) che possono essere facilmente controllati al fine di escludere possibili fattori di rischio.

L’eliminazione delle modifiche indesiderate, comprese le sequenze eterologhe dei marcatori di selezione (necessari nel caso frequente di trasformazione mediata da Agrobacterium) e della proteina CAS necessaria per effettuare le modifiche richieste, può avvenire solo mediante una selezione da progenie segreganti che però nelle piante a propagazione vegetativa comporta la perdita delle caratteristiche del clone originale.

Con tale tecnica è già stato possibile ottenere nuove piante mutate per geni di resistenza a patogeni, come, ad esempio, in vite per resistenza a botrite e oidio. Ora il problema è trovare una strategia per portarle sul mercato.

L’uso del sistema CRISPR/Cas9 nella fragola ottoploide è già stato testato per colpire il gene omeotico che controlla il differenziamento a fiore APETALA3 (AP3). Le linee di fragola sviluppate da questo “gene editing” mostravano difetti nello sviluppo di stami e frutti. L’analisi del locus mirato ha indicato differenze nell’editing genico tra le diverse linee modificate da CRISPR e ha anche identificato linee con mutazioni in tutte e otto le copie AP3 nel genoma della fragola. Tutte queste mutazioni sono risultate stabili in piante clonate mediante stolone, dimostrando il mantenimento delle modifiche CRISPR/Cas9 nella propagazione vegetativa delle piante di fragola.

Questo lavoro preliminare eseguito da Carmen Martin-Pizarro e David Posé Padilla dell’Università di Malaga (Spagna) dimostra che il sistema CRISPR/Cas9 è uno strumento funzionale per l’editing del genoma in fragola coltivata allo scopo di eseguire analisi funzionali dei geni in questa coltura e anche per ottenere nuovi genotipi con tratti migliorati/corretti. La principale limitazione per l’applicazione di tutte queste tecnologie rimane la disponibilità di efficienti protocolli di rigenerazione, trasformazione e selezione da applicare a tutte le cultivar da modificare. La via del “gene editing” diretto su protoplasti trova il limite della difficoltà di rigenerazione sempre più “genotipo dipendente” e dall’elevata frequenza di variabilità somaclonale rilevata nelle linee rigenerate.

RNAi e silenziamento genico

Il silenziamento genico o “RNA interference” (RNAi) offre altre opportunità, in particolare per creare nuove varietà di fragola resistenti alle malattie. Lo scambio di piccole molecole di RNAi da pianta a patogeno (“cross-kingdom”) viene ora utilizzato come nuova arma per contrastare patogeni (virus, funghi, batteri) e parassiti (insetti, nematodi) delle colture agrarie (Wang et al. 2017).

Una nuova pianta modificata per l’espressione di sequenze di RNAi, capaci di silenziare geni del patogeno/parassita che si vuole controllare (HIGS: “host-induced gene silencing”), risulta con una resistenza stabile al patogeno/parassita, ma è ancora un OGM, anche se diverso dai tradizionali perché non esprime proteine/enzimi, ma solo piccole molecole di RNAi (15-24 basi), quindi risulta più facile da dimostrare l’assenza di rischi per salute e ambiente. L’efficacia della tecnologia è già stata dimostrata per indurre resistenza a insetti; per la fragola e i piccoli frutti di particolare rilevanza sono i risultati ottenuti dal gruppo di lavoro coordinato dal Prof. Guy Smagghe (Università di Gent) per controllare gli attacchi da Drosophila suzuki.

Per quanto riguarda i patogeni, risultati importanti sono già stati ottenuti per molte specie (susino-virus PPV, frumento-ruggine, botrite-vite/pomodoro). Anche per la fragola è stata dimostrata l’efficacia di sequenze di RNAi nel controllare l’infezione di botrite e Verticillium (Wang et al., 2016). In realtà la novità più importante nella difesa vegetale è quella di spruzzare sulla superficie delle piante soluzioni costituite da molecole di RNAi, stabilizzate con diversi nanomateriali (SIGS: “spray-induced gene silencing”), capaci di penetrare nei tessuti e di interferire con i geni di virulenza di patogeni, di replicazione o di difesa dei parassiti, bloccando l’infezione.

Studi molto avanzati sui meccanismi di assorbimento delle molecole di RNAi da parte di patogeni e parassiti stanno portando a nuovi formulati efficaci su insetti (es. Drosophila) e funghi (botrite). I nuovi formulati a base di molecole di RNAi sono a target altamente sequenza-specifico in quanto possono essere ‘disegnati’ in modo da interferire con uno o più geni specifici dell’organismo target (minor rischio di sviluppo di resistenze) e, quindi, meno impattanti per l’ambiente e per gli altri organismi non target (tra cui il consumatore). La diffusione di questi prodotti dipenderà dalla riduzione dei costi di produzione, ancora abbastanza elevati, e dallo sviluppo di nuovi formulati (sono in studio diversi nanomateriali) capaci di stabilizzare le molecole di RNAi rendendole efficaci per periodi più lunghi.

Queste sono le innovazioni offerte dalle conoscenze genetiche molecolari che in un prossimo futuro, sicuramente in diversi Paesi, contribuiranno a ridurre l’uso di pesticidi in agricoltura, rendendola più sostenibile e sicura. In Europa e in Italia tali applicazioni probabilmente rimarranno limitate fino a quando non si deciderà di affrontare il problema della corretta informazione sui pesticidi usati nei sistemi agricoli, compreso quello biologico, facendo un giusto confronto sui vantaggi che si possono ottenere combinando pratiche colturali a basso impatto con l’utilizzo di nuove piante e prodotti con meccanismi di difesa molecolare di precisione.

L’importanza della sperimentazione in campo

Nel luglio 2018 la Corte di Giustizia Europea si è espressa classificando tutte queste NBTs come OGM; non poteva essere diversamente perché tutte basate sul DNA ricombinante (DNA “taglia e cuci”). Questo non deve essere considerato come un dramma, anzi l’applicazione dell’attuale normativa è elemento di garanzia della sicurezza per l’ambiente e per i consumatori di tutti i prodotti biotecnologici. La modifica dell’approccio di valutazione da metodo a prodotto semplificherebbe il processo di valutazione rendendolo più mirato a valutare i reali fattori di rischio ma i ‘tempi della politica’ risultano ancora molto lunghi (altri 5-10 anni?) e incerti. Al fine di cercare di modificare questa situazione in tempi brevi, diventa importante mobilitare tutti i ricercatori con prodotti biotecnologici nell’invio di notifiche secondo l’attuale normativa, così da forzare l’avvio della sperimentazione in campo (Fig. 2) per valutare in modo concreto in campo i possibili vantaggi delle NBTs per la nostra agricoltura e, in particolare, per la coltivazione della fragola.

L’approccio SIGS è caratterizzato dall’uso di piccole molecole di RNA di difesa, considerate molto più precise verso il target scelto, rispetto ad altre piccole molecole, come peptidi o estratti da varie sostanze o organismi ora utilizzati. In ambito EFSA è in corso una discussione su come questi nuovi formulati a base di molecole di RNAi potranno essere regolamentati e portati sul mercato e agli agricoltori. La creazione di nuovi formulati a costi sostenibili, possibilmente classificati come biopesticidi o addirittura biostimolanti, potrà forse rivoluzionare, anche prima delle NBTs, le strategie di difesa della fragola e di diverse piante coltivate.

SEQUENZIATO IL GENOMA DELLA FERAGOLA:
BREEDING AGEVOLATO PER L'INNOVAZIONE VARIETALE

È stato appena ultimato (Nature Genetics, marzo 2019) il sequenziamento del genoma della fragola ad opera di tredici istituzioni di ricerca americane. Patrick P. Edger della Michigan State University (East Lansing) e Steven J. Knapp dell’Università di California (Davis) hanno guidato l’analisi molecolare che ha rivelato le origini e l’evoluzione della fragola coltivata (Fragaria x ananassa, 2n = 8x = 56 cromosomi e oltre centomila geni). Hanno scoperto che la fragola deriva dall’ibridazione interspecifica di specie selvatiche ottoploidi avvenuta circa trecento anni fa. A loro volta queste discendono dalla fusione in un singolo nucleo di quattro specie diploidi risalenti a più di un milione di anni fa.
La fragola è dunque un esempio di un complesso allopoliploidismo, costituito da quattro sub-genomi, uno dei quali dominante sugli altri per un maggior contenuto di geni espressi e interagenti con altri cromosomi omologhi dello stesso genoma, capaci di controllare sia caratteri di resistenza delle piante, sia importanti processi metabolici nella fisiologia della fruttificazione.

Il lavoro scientifico è molto accurato e soprattutto svolto con le tecnologie più moderne, automatizzate di analisi del DNA. Ottimo anche il confronto che ha rivelato le sintenie fra i due genomi sequenziati di fragola (cv Camarosa e F. vesca con quelli di Arabidopsis thaliana e Malus x domestica) al fine di evidenziare i passaggi filogenetici nelle varie epoche evolutive.

Gli studiosi della fragola ora, dunque, hanno a disposizione un’incredibile mole di dati e punti di riferimento: la libreria di RNA estratta dalla collezione tissutale e il conseguente assemblaggio e la traslazione del trascrittoma; le annotazioni geniche, le sequenze ripetute di caratteri identitari. L’analisi dell’espressione genica e delle famiglie geniche coinvolte nella resistenza è di estrema utilità per i breeder della fragola (e sono tanti nel mondo), perché potranno incrociare linee parentali portatrici di caratteri già codificati e selezionare semenzali in assai più breve periodo. Penso che il sistema americano potrà assicurare la consulenza e l’assistenza ai programmi di breeding anche italiani finalizzati, ad esempio, a determinati ambienti diversi per altitudine e latitudine, oppure ad ottenere fragole adatte a periodi extra-precoci o tardivi.

Le fonti della pubblicazione sono: Nature Genetics, 51, numero 2019, 541-547, www.nature.com/naturegenetics, oppure i due citati coordinatori dello studio americano.