Lo sviluppo delle ricerche nel settore delle biotecnologie sta sempre più interessando la difesa antiparassitaria, fornendo mezzi innovativi che favoriscono l’applicazione di strategie “ecocompatibili”. Considerando quanto si è verificato negli ultimi 50 anni, emerge evidente che, grazie a varie ricerche di base, si sono potuti ottenere risultati fondamentali, in gran parte già largamente applicati. Molti di essi sono proprio di natura biotecnologica.
La “biotecnologia” è la tecnologia che si serve di organismi viventi o di sostanze da essi derivate per modificare prodotti o processi a fini specifici. Dall’inizio degli anni ’70 del secolo scorso i progressi nelle strategie e nei mezzi a disposizione per la difesa integrata in frutticoltura sono stati continui sia nel settore dell’entomologia agraria, sia in quello della patologia vegetale (Butturini e Galassi, 2014)
L’aumento dell’importanza dei “mezzi biotecnici” si può agevolmente seguire consultando il capitolo ad essi dedicato nei Prontuari degli agrofarmaci che, di edizione in edizione, occupa sempre più spazio (Muccinelli et al., 2011).
Gli argomenti, oggetto di specifici approfondimenti scientifici, sono molteplici e non è facile riuscire ad avere un quadro esauriente sullo stato delle conoscenze di base e sulle imminenti possibilità applicative nella difesa dei fruttiferi e della vite. L’Accademia dei Georgofili ha colto questa esigenza e ha organizzato nel dicembre scorso, a Firenze, un’apposita Giornata di Studio invitando i maggiori specialisti italiani ad illustrare quanto si stia facendo nei settori di loro competenza.
Il controllo microbiologico degli insetti
Le prospettive di controllo microbiologico degli insetti sono state trattate da Floris (Floris et al., 2016) che ha evidenziato, come premessa, l’elevato tasso di crescita dei bio-pesticidi nell’ambito del mercato globale degli agrofarmaci. Le cause sono molteplici e interessano anche molti altri prodotti biotecnologici. Il crescente successo del controllo microbiologico degli insetti è in gran parte attribuibile alla disponibilità di formulati sempre più efficaci e con spettro d’azione più ampio. Vari microrganismi, tra cui batteri, funghi, virus, protozoi e nematodi, si comportano come agenti entomopatogeni e si prestano ad essere formulati come insetticidi.
I batteri
Ricoprono certamente un ruolo preminente. Sono soprattutto le specie sporigene ad avere importanza e tra esse primeggiano quelle del genere Bacillus. Ormai da decenni vari ceppi di Bacillus thuringiensis sono utilizzati per combattere larve di lepidotteri, ma anche di coleotteri e di ditteri. Diversi ceppi di B.t. producono differenti tossine. Durante la fase vegetativa vengono prodotte le tossine Vip, mentre in fase di sporulazione vengono prodotte due esotossine e le più note delta-endotossine, conosciute anche come proteine Cry. La selettività di azione dei diversi ceppi di B.t. dipende dalla capacità delle proteine Cry di legarsi selettivamente a specifici recettori presenti sull’epitelio dell’intestino delle larve degli insetti sensibili. Tali recettori di membrana sono presenti esclusivamente nelle specie di insetti “target” e mancano negli altri animali e nell’uomo. I geni che codificano per queste proteine sono stati utilizzati per trasformare alcune specie vegetali. La pianta è così in grado di sintetizzare la proteina Cry già nella forma attiva e di autodifendersi dagli attacchi di alcuni fitofagi.
Questo è il grande capitolo delle piante geneticamente modificate. Alcune piante erbacee, quali mais e soia, sono largamente coltivate in varie parti del mondo, ma incontrano altissime resistenze in Europa. Questo atteggiamento negativo contribuisce a ostacolare tutta l’attività di ricerca del settore precludendo quanto si potrebbe ottenere anche nel miglioramento delle piante arboree. Varie ricerche sono in corso su altri batteri quali Lysinibacillus sphaericus, che manifesta efficacia contro ditteri (culicidi chironomidi e simulidi) e Paenibacillus popilliae, agente della “milky disease” delle larve di coleotteri.
I batteri hanno fornito un altro prezioso contributo alla difesa delle piante grazie alla loro produzione di metaboliti. Due casi hanno ormai consolidato il loro successo commerciale: le avermectine e le spinosine. Le prime sono lattoni macrociclici originati da processi fermentativi ad opera di un ceppo dello Streptomyces avermitilis (Actinobacteria); comprendono le abamectine, l’emamectina benzoato e la milbectina, tutte largamente utilizzate in frutticoltura contro vari gruppi di insetti e di acari. Le spinosine, prodotte da Saccharopolyspora spinosa, sono anch’esse dei lattoni macrociclici. La loro attività insetticida si manifesta contro lepidotteri, tisanotteri e ditteri. Lo Spinosad, costituito dai due metaboliti che possiedono l’efficacia insetticida più elevata, è ammesso in agricoltura biologica ed è formulato sia per trattamenti alla vegetazione, sia come esca per ditteri tefritidi quali la mosca della frutta e la mosca delle olive.
I virus
Hanno una minore importanza applicativa rispetto ai batteri nonostante i baculovirus abbiano la capacità di infettare insetti appartenenti a vari ordini. I baculovirus si distinguono in virus della poliedrosi nucleare e in granulovirus. Non sono infettivi per vertebrati e per piante e manifestano la loro azione limitatamente all’ordine, oppure alla specie, da cui sono stati isolati.
In Italia ha importanza il virus della granulosi della carpocapsa (CpGv) di cui esistono in commercio alcuni formulati, autorizzati all’impiego su melo, pero, cotogno, noce e nashi (Fig.1). L’uso del virus è particolarmente apprezzato per combattere le larve della prima generazione.
I funghi
Sono stati oggetto di studi fin dalla metà del diciannovesimo secolo. Beauveria bassiana è la specie che Agostino Bassi studiò a Pavia per la malattia che provocava alle larve del baco da seta. I conidi dei funghi entomopatogeni producono ife in grado di perforare la cuticola e penetrare all’interno del corpo degli insetti. Le condizioni ambientali sono determinanti per la germinazione dei conidi e possono essere causa del successo o dell’insuccesso dell’azione parassitaria dei funghi.
La già citata B. bassiana ha un certo impiego in agricoltura, più limitato è quello di Metarhizium anisopliae che viene impiegato come formulato granulare per combattere insetti del terreno, in particolare l’oziorrinco della vite. L’uso dei funghi come mezzo di lotta trova un limite nell’elevata esigenza di condizioni adatte e nell’effetto negativo che possono avere i trattamenti fungicidi.
I semiochimici in agricoltura
I semiochimici sono molecole bio-funzionali che regolano le relazioni tra gli organismi viventi. Nel vastissimo campo d’indagine della comunicazione chimica, che ha un ruolo primario per gli insetti, rientrano gli studi sui feromoni che, nella citata giornata di studio dell’Accademia dei Georgofili, sono stati presentati da Rotundo per quanto concerne gli aspetti della ricerca di base e da Germinara per le applicazioni in campo (Rotundo G. e Germinara S., 2016).
I feromoni hanno indubbiamente contribuito al sostanziale cambiamento della difesa delle colture. Le trappole a feromone hanno facilitato il monitoraggio di specie dannose, particolarmente di lepidotteri. Il significato delle catture con tali trappole varia da specie a specie e non sempre è interpretato correttamente, ma, nonostante alcuni loro limiti, attualmente non è più pensabile rinunciare a tali preziosi strumenti. Altro fondamentale apporto si è avuto con l’impiego dei feromoni come mezzi di lotta. I maggiori risultati sono stati ottenuti nei confronti di alcuni lepidotteri dannosi in frutticoltura e viticoltura.
Esistono in commercio sistemi di erogazione di feromone che si basano su differenti principi. Con alcuni erogatori si ottiene la cosiddetta “confusione sessuale”. Il feromone viene diffuso nell’aria in modo da impedire ai maschi la percezione dei richiami emessi dalle femmine, e quindi di accoppiarsi. Si ritiene che l’effetto possa essere dovuto alla saturazione dei recettori olfattivi antennali oppure all’assuefazione del sistema nervoso centrale. Il “disorientamento” si ottiene invece collocando in campo un numero elevato di erogatori che simulano la naturale emissione delle femmine. La competizione con l’emissione naturale impedisce ai maschi di distinguere i richiami emessi dalle femmine. Molto lavoro è tuttora in atto per trovare nuovi sistemi di erogazione (Fig. 2). Tra essi si segnala la tecnica “puffer” che si basa su un dispositivo temporizzato in grado di rilasciare dosi prestabilite di feromone. Il metodo ha fornito buoni risultati applicato nei meleti e nei vigneti.
Un altro metodo è quello dell’“auto-confusione”; i maschi vengono attratti in trappole in cui il feromone, allo stato polverulento, rimane aderente al corpo dell’insetto e gli impedisce di percepire il feromone naturale. La lotta contro lepidotteri dannosi mediante i feromoni ha un’applicazione su larga scala a livello mondiale (Fig. 3). In Italia le specie maggiormente interessate sono Cydia pomonella delle pomacee, Cydia molesta del pesco e Lobesia botrana della vite.
I microrganismi per il controllo delle malattie delle piante
A Firenze, la relazione di Felice Scala ha evidenziato che i prodotti a base di microrganismi e sostanze naturali per il controllo delle malattie delle piante autorizzati in Italia sono abbastanza pochi (Scala F., Lorito L., 2015). In Europa il loro numero è leggermente superiore, ma sempre decisamente inferiore a quello di altri Paesi, tra cui gli Stati Uniti, in cui le procedure autorizzative sono più rapide. Il processo di selezione a cui microrganismi antagonisti e molecole bioattive vengono sottoposti è laborioso e complesso. La tendenza attuale è quella di privilegiare ceppi con funzioni utili sia per la protezione delle piante, sia per il loro sviluppo.
Funghi antagonisti del genere Trichoderma forniscono la possibilità di ricerca di ceppi multifunzionali, molti dei quali possiedono un’elevata “competenza rizosferica” cioè su funghi del suolo che attaccano le radici. Altri microrganismi oggetto di studio per effetti benefici simili sono i rizobateri promotori della crescita delle piante (PGPR) e i funghi micorrizici. Anche questi vivono simbioticamente sulle radici. Per migliorare l’applicazione dei microbi benefici si stanno utilizzando tecniche di genomica funzionale che appaiono promettenti.
Recente è l’interesse per il “microbioma” della rizosfera che ha evidenziato l’importanza di introdurre nel suolo comunità sintetiche di microrganismi benefici. Tali consorzi microbici possono consentire al microbioma di rafforzarsi ed escludere competitivamente i patogeni. Per aumentare le possibilità applicative dovranno poi essere migliorate le formulazioni e i sistemi di applicazione. La registrazione di nuovi prodotti rimane uno dei problemi maggiori da superare.
Gli induttori di resistenza
L’induzione di resistenza nelle piante consiste nello stimolare l’attivazione di meccanismi di difesa mediante elicitori, molecole di sintesi o naturali che mimano l’attacco di un patogeno o uno stato di stress. In questo settore sono impegnati diversi gruppi di ricerca. Una sintesi di quanto si sta facendo in Italia è stata presentata da Faretra (Faretra F. et al., 2016). Gli induttori di resistenza hanno origine diversa: oltre a induttori di sintesi e induttori microbici, ci sono vari estratti vegetali, compost derivati dalla biodegradazione di rifiuti organici e “biochar” derivante dalla pirolisi di biomasse che hanno dimostrato di possedere la capacità di indurre resistenza sistemica in alcune piante. Una delle limitazioni maggiori degli induttori di resistenza è la loro efficacia parziale. Molteplici fattori quali, ad esempio, le condizioni ambientali, il patosistema e il genotipo delle piante coltivate influenzano l’attività degli elicitori.
Appare prevedibile che le tecnologie di sequenziamento massale e di metabolomica impiegate per chiarire il fenomeno dell’induzione di resistenza potranno fornire un importante supporto scientifico al progresso del settore. Attualmente è comunque in atto il dibattito su come gli induttori di resistenza debbano essere considerati. Saranno considerati prodotti fitosanitari, biostimolanti, corroboranti o fertilizzanti? Le difficoltà e i costi per ottenere l’autorizzazione all’impiego sono assai differenti. La chiarezza su quali norme regolamenteranno il loro impiego sarà determinante per il futuro di questa categoria di prodotti che potrebbero bene inserirsi in strategie di produzione integrata assieme agli altri mezzi si difesa più tradizionali.
I microrganismi benefici del suolo
Le radici delle piante interagiscono nel suolo con un complesso di microrganismi, alcuni nocivi, altri benefici. Tra i microrganismi che sono stati correlati al miglioramento della salute delle piante e della loro capacità di tollerare stress, sia abiotici che biotici, figurano i funghi micorrizici arbuscolari e i batteri promotori della crescita.
I primi sono potenziali agenti di bio-controllo. La riduzione della crescita dei patogeni è dovuta a fenomeni di competizione e all’induzione di reazioni di difesa da parte della pianta. I batteri promotori della crescita, invece, sono in grado di formare simbiosi con le piante e colonizzare i tessuti interni delle radici. Sono ritenuti in grado di esercitare attività soppressiva nei confronti di malattie che originano dal suolo. Le ricerche in atto presso l’Università del Piemonte Orientale su questo tema sono state presentate da Berta (Berta G. et al., 2016). Varie sperimentazioni sono state effettuate, prevalentemente in laboratorio e in ambiente controllato. Interessanti sono i risultati ottenuti, in condizioni di pieno campo, su viti affette da flavescenza dorata. Il trattamento con batteri endofiti sembra alleviare la sintomatologia delle piante. Le ricerche appaiono promettenti e verranno completate con uno studio metagenetico per valutare le differenze nel microbioma di piante sane e piante infettate da fitoplasmi allo scopo di individuare microrganismi potenzialmente adatti per interventi terapeutici o preventivi.
La resistenza transgenica indotta dal patogeno
Le piante geneticamente modificate sono largamente coltivate a livello mondiale e molti prevedono una loro ulteriore espansione. Per ora l’atteggiamento dell’Europa rimane ostile a tali coltivazioni, ma alcuni Paesi membri dell’Ue hanno già iniziato a permettere la coltivazione di mais transgenico. Il dibattito è ancora molto acceso e attualmente è difficile fare previsioni. Per ora le colture maggiormente interessate sono soia, colza ed erba medica, resistenti ad alcuni erbicidi, e mais e cotone resistenti a insetti. Meno frequenti sono le ricerche riguardanti piante ingegnerizzate per la resistenza a malattie fungine e batteriche.
Secondo quanto illustrato da Rubino e Martelli, più incoraggiante è la situazione delle piante geneticamente modificate per la resistenza ai virus (Martelli G.P., Rubino L., 2016). Contro questi patogeni non si può contare su lotta chimica o interventi biologici. La soluzione può quindi essere ricercata facendo ricorso al miglioramento genetico tradizionale. Non è però facile trovare fonti naturali trasferibili nelle specie coltivate da quelle selvatiche che le possiedono. L’uso della “resistenza derivata dal patogeno”, biotecnologia basata sul DNA ricombinante, ha aperto la via alla resistenza transgenica. La resistenza transgenica ai virus si esplica attraverso due principali meccanismi denominati “resistenza indotta da proteine” (“protein-mediated resistance”) e “resistenza indotta da acido ribonucleico” (“RNA-mediated resistance”). La sperimentazione effettuata nell’ultimo ventennio è stata abbondante e ha interessato anche importanti piante agrarie.
I casi di piante geneticamente modificate resistenti ai virus entrate in commercio sono limitati. Il maggior successo è quello ottenuto su papaia (Carica papaya) trasformata per la resistenza al polyvirus della maculatura anulare (PRSV) nelle Hawaii e sul susino “Honey Sweet” resistente al virus della vaiolatura (PPV), sviluppato in Europa ma ammesso anche alla coltivazione negli Stati Uniti. Le scarse ricadute pratiche di un metodo che ha dimostrato indubbia validità sono attribuibili alla perdurante ostilità verso le piante transgeniche che scoraggia la ricerca pubblica.
Oltre che con la “transgenesi”, si possono ottenere interessanti risultati anche con la “cisgenesi” che consiste nel trasferimento artificiale di singoli geni tra organismi dello stesso genere e quindi incrociabili e interfertili. Un recente importante risultato riguarda il melo (cv. Gala) reso resistente alla ticchiolatura (Venturia inaequalis) con il trasferimento del gene HcrVf2 da Malus floribunda, di concerto tra le Università di Zurigo e Bologna. La possibilità di ricorrere alla cisgenesi consentirebbe di ottenere gli stessi risultati del miglioramento genetico tradizionale, ma con un percorso sensibilmente più breve.
Autorizzazione all’impiego
Il quadro normativo per l’autorizzazione degli agro-bi-ofarmaci è fondamentalmente composto dal Reg. Ue 1107/2009 dei prodotti fitosanitari e dalla Direttiva europea 2009/128/Ce sul loro “uso sostenibile”. Il sistema autorizzativo è complessivamente riferito a prodotti chimici di sintesi e presenta varie difficoltà nella applicazione alle varie tipologie di mezzi biotecnici. Franceschini dell’International Biocontrol Manifactures Association (IBMA) ha commentato questa situazione sottolineando che i requisiti validi per gli prodotti chimici di sintesi mal si adattano alla valutazione di microrganismi, feromoni o estratti vegetali. Il sistema autorizzativo attuale rallenta lo sviluppo e la commercializzazione di metodi alternativi di lotta (Franceschini S., Veronelli V., 2015). Viene quindi sollecitata l’introduzione di una normativa specifica per le diverse tipologie di agrofarmaci biologici.
