Il melo è ospite di svariati virus, alcuni dei quali sono agenti di patologie presenti in tutte le aree di coltivazione del mondo. La loro infezione risulta però generalmente di tipo latente, anche se nel caso di genotipi molto suscettibili, e nel caso di infezioni miste, la sindrome virale può risultare molto grave. Le principali malattie sono: scanalatura del tronco, butteratura del tronco e maculatura clorotica del melo.
Questi tre virus vengono trasmessi per innesto e diffusi quindi attraverso la moltiplicazione vegetativa. I frutticoltori più previdenti, quindi, impiegano astoni prodotti seguendo i protocolli nazionali di certificazione genetico – sanitaria. Il processo di certificazione volontaria nazionale delle produzioni vivaistiche (Decreto Mipaaf del 19 marzo 2019), così detta “Qualità Vivaistica Italia”, offre maggiori garanzie di sanità sulle piantine prodotte, stante un numero maggiore di controlli fitosanitari sulle produzioni vivaistiche. In tale ambito, un ruolo di fondamentale importanza viene svolto dall’attività diagnostica. Questa, come noto, si può avvalere di saggi biologici utilizzando appropriate piante indicatrici (indexaggio) e di analisi di laboratorio di tipo sierologico (ELISA) e molecolare (RT-PCR e ddRT-PCR).
La diagnosi biologica con specifici indicatori legnosi è tuttora una fase obbligatoria in qualsiasi programma di certificazione vivaistica; si effettua in pieno campo e richiede dai 2 ai 5 anni di rilievi sintomatologici per ottenere i risultati. Nel tentativo di velocizzare la procedura, è stata quindi sperimentata in passato l’esecuzione dell'indexaggio in serra su piantine indicatrici allevate in vaso (Fridlund, 1980). In Italia, al momento, le conoscenze su questo argomento sono molto limitate e si è perciò deciso di avviare uno specifico studio, in collaborazione tra il CAV e l’Università di Bologna, per verificarne la reale applicabilità nello specifico contesto produttivo in cui operiamo.
Metodologia sperimentale
Le prove di diagnosi biologica in serra dei principali virus del melo sono state effettuate nel 2019 presso le strutture tecniche-scientifiche del CAV (a Tebano di Faenza), seguendo la metodologia del doppio innesto. Quali sorgenti d’inoculo sono state individuate 15 diverse piante risultate infette in base a precedenti saggi biologici di campo e/o di laboratorio (ELISA e/o RT-PCR). Di queste 3 piante erano infette da ASGV, 1 da ASPV, 3 da ASGV+ASPV, 5 da ACLSV e 3 da ACLSV+ ASPV.
Gli indicatori valutati in serra erano i seguenti: Virginia Crab (per evidenziare ASPV e ASGV), Radiant (ASPV), Spy 227 (ASPV e ACLSV) e R 12740-7A (ACLSV).
Gli innesti-inoculi sono stati effettuati in primavera (a gemma vegetante) e poi ripetuti nell’autunno (a gemma dormiente). Due gemme legnose degli indicatori provenienti da specifiche piante madri in conservazione al CAV – escluso il Radiant da micropropagazione usato direttamente – sono state innestate su semenzali di melo (diametro di circa 1 cm) virus-esenti allevati in serra in appositi vasetti. In posizione sottostante, sono stati effettuati gli innesti-inoculi con due gemme, o in alternativa scudetti di tessuto corticale, delle fonti infette dai virus. Per il confronto sano sono state utilizzate gemme di una pianta accertata sana. Per ogni indicatore/infezione virale sono state effettuate 10 ripetizioni. Successivamente, al fine di favorire lo sviluppo delle indicatrici, è stata asportata la porzione superiore del portainnesto e dei germogli delle gemme dell’inoculo.
Le piante sono state allevate in serra condizionata (22-26 °C) e nelle settimane-mesi a seguire soggette agli specifici rilievi sintomatologici. Riguardo la prova a gemma dormiente, le piante sono state invece mantenute all’aperto sotto tunnel per tutto l’inverno per poi essere spostate in serra la primavera successiva del 2020.
Risultati e conclusioni dell'indexaggio
Virginia Crab: Tipici sintomi fogliari (fig. 2A e fig. 2B) sono stati osservati in tutti i gruppi di piante inoculate con le fonti d’infezione contenente ASGV, sia singolarmente (isolati 1, 4, 7) sia in associazione con ASPV (isolati 3, 8, 14). Questi si sono manifestati molto chiaramente, su 2-5 foglie/pianta, a circa due mesi dall’inoculo, per poi scomparire all’avanzare dello sviluppo vegetativo. Sono state evidenziate anche le caratteristiche anomalie del legno come lo strato di tessuto necrotico a livello della linea d’innesto (fig. 3A), non rilevabile nei controlli sani (fig. 3B), e le scanalature nel legno lungo il fusto dell’indicatrice (fig. 3C). Il controllo di tale sintomatologia è stato effettuato rispettivamente dopo 5 mesi e nella primavera successiva all’innesto-inoculo (11 mesi). Virginia Crab si è invece dimostrata poco affidabile per la specifica diagnosi di ASPV in serra, registrando su alcune piante solamente una leggera butteratura del legno sopra l’innesto al rilievo degli 11 mesi; questo sia nel caso di infezione singola (isolato 11) sia in associazione con ACLSV (isolati 2, 10).
Spy 227 e Radiant: Questi indicatori sono ambedue risultati molto reattivi all’infezione di ASPV. Tutti i gruppi di piante inoculate sia con il singolo virus (isolato 11) sia combinato con ASGV (isolati 3, 8, 14) o con ACLSV (isolati 2, 10, 15), con alta frequenza hanno manifestato i caratteristici sintomi di incurvamento delle foglie (epinastia), nanismo e deperimento della vegetazione (fig. 4A, 4B). Nelle nostre condizioni operative la risposta di Spy 227 è risultata inoltre di particolare gravità, registrando anche alte incidenze di mortalità fra le piante.
R 12740-7A: La pianta indicatrice ha chiaramente evidenziato le infezioni di ACLSV, sia quando presente singolarmente (isolati 18A, 18B, 18C, 19A, 19B) sia quando associato ad ASPV (isolati 2, 10, 15). Queste le manifestazioni patologiche osservate: maculatura clorotica, deformazione delle foglie e nanismo dello sviluppo vegetativo (fig. 6); all’avanzare della stagione tali sintomi poi gradualmente si sono attenuati. Con questi isolati virali si sono registrate anche piante inoculate di Spy 227 con maculatura clorotica e malformazione fogliare. Tuttavia, è la sindrome espressa da R 12740-7A che si deve ritenere più specifica per ACLSV.
Tempi ridotti rispetto alla metodologia in campo
La sperimentazione ha confermato l’importanza di ricorrere almeno a tre repliche per ciascun indicatore anche con gli eventuali biosaggi di serra, come già da tempo si fa con quelli effettuati in pieno campo.
Le informazioni ottenute dalle prove effettuate evidenziano la validità dell’indexaggio in serra per i principali virus del melo. Grazie a tale procedura si sono ottenute le risposte diagnostiche da parte degli specifici indicatori legnosi dopo pochi mesi dall’innesto-inoculo. Considerando quindi gli svantaggi della tradizionale metodologia di campo, quali lo spazio e il tempo richiesti (2 - 5 anni), così come la variabilità e/o la possibile mancanza di sintomi nei differenti anni dovuti alle condizioni ambientali non controllate, la tecnica qui presentata deve considerarsi di notevole interesse applicativo e quindi altamente consigliabile nell’attività diagnostica per la certificazione dei materiali moltiplicativi permettendo di ridurne i tempi e i costi; indipendentemente dalle congiunte metodologie diagnostiche, enzimatiche o molecolari.
