Negli ultimi decenni l’uso massiccio di prodotti chimici per far fronte agli stress biotici e abiotici delle piante da frutto ha aggravato il deterioramento della fertilità del suolo e aumentato i costi di produzione e l’inquinamento dell’agro-ecosistema. Per ovviare a questi problemi e per preservare la produttività, la qualità della frutta e la sicurezza ambientale, lo sviluppo di prodotti microbiologici, biostimolanti o fitoprotettivi, ha acquisito, negli ultimi anni, un nuovo slancio. Infatti, il microbiota associato alla pianta, noto anche come fitobiota, influenza diversi tratti funzionali in grado di apportare benefici alla pianta ospite, come la protezione da parassiti e agenti patogeni, la maggiore capacità di acquisire nutrienti, la stimolazione della crescita e l’influenza sul metabolismo delle piante per adattarsi agli stress abiotici. Inoltre, il fitobiota influenza anche la qualità e l’aroma dei frutti. Complessivamente, queste capacità potrebbero essere sfruttate per affrontare le sfide poste dal cambiamento climatico, fornendo un’alternativa sostenibile all’uso di pesticidi, fertilizzanti chimici e bioregolatori. Infine, il fitobiota si adatta funzionalmente in risposta a stress sia biotici sia abiotici mitigando il loro effetto sulla pianta ospite. Questa nota riporta uno studio condotto utilizzando la fragola come pianta modello per sviluppare una nuova tipologia di biostimolanti microbici in grado di aumentarne la resistenza agli stress.
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Lo studio sul microbioma innato di tre cultivars di fragola
A tal fine, il microbioma innato di tre diverse cultivars di fragola è stato caratterizzato a livello funzionale in modo da identificare le specie ubiquitarie e con un ruolo chiave per la resistenza della pianta alla salinità e per una migliore tolleranza degli effetti negativi causati dalle infezioni da Xanthomonas fragarie, uno dei principali patogeni di questa coltura. Lo studio è stato condotto su fragola non solo per la sua importanza economica, essendo tra le più importanti colture frutticole prodotte a livello globale, con un aumento del +20% della superficie raccolta tra il 2011 e il 2021 (Faostat, 2023), ma anche perché è una delle colture che richiede un elevato numero di trattamenti fitosanitari e che ha la maggior sensibilità alla salinizzazione, problema crescente in tutto il bacino del Mediterraneo, inclusa l’Italia.
Sebbene, per almeno tre decenni, la comunità scientifica abbia lavorato allo sviluppo di biostimolanti microbici, questi spesso mancano di efficacia quando applicati sul campo, oppure hanno un effetto diverso al variare delle condizioni ambientali e colturali. La scarsa efficacia e ripetibilità dei risultati è principalmente dovuta all’incapacità dei microbi inoculati di colonizzare efficacemente gli organi delle piante e di collaborare con il microbiota naturale. Proprio per ovviare a questo problema, il nostro studio si è focalizzato sul microbiota nativo, selezionando batteri già naturalmente simbionti con la pianta e adattati ad essa. A tal fine, il microbioma è stato caratterizzato per tutti gli organi della pianta (foglie, frutti, radici) e compartimenti (rizosfera e suolo) in modo da identificare (I) i potenziali batteri in grado di promuovere la crescita delle piante (PGPB) e la produttività dei frutti anche in condizioni di stress salino e (II) gli agenti di controllo biologico (BCA) contro X. fragariae.
I microrganismi isolati sono stati poi caratterizzati in vitro per le loro attività funzionali di stimolazione di crescita (produzione di IAA, acetoina, produzione di siderofori, produzione di NH4), riduzione dello stress (ACC-deaminasi) e di antagonismo verso X. fragariae. La produzione di IAA, un’auxina biologicamente attiva, promuove la crescita, facilita l’acquisizione dell’azoto e contribuisce alla differenziazione a fiore e alla crescita del frutto. L’acetoina e il suo prodotto diretto, il 2,3-butanediolo, incrementano sia la crescita della pianta, sia la resistenza allo stress e ai patogeni. Il meccanismo d’azione è poco noto, ma diverse ricerche suggeriscono una complessa interazione di questi composti sia con le auxine, sia con l’acido abscissico. I siderofori batterici e produzione di ammonio hanno un effetto positivo sulla crescita fornendo minerali essenziali come ferro e azoto. Infine, l’attività di ACC-deaminasi, riduce i livelli in pianta di etilene, poiché metabolizza l’acido 1-amminociclopropancarbossilico, il precursore diretto dell’etilene. Come noto, l’etilene ha un ruolo di inibizione della crescita della pianta e, pertanto, una riduzione nel suo livello mitiga anche gli effetti negativi di inibizione.
Successivamente, i batteri selezionati che mostravano attività di promozione della crescita e/o di controllo biologico in vitro sono stati applicati individualmente su piante di fragola in condizioni non normali o di stress biotico (inoculazione di X. fragariae) o abiotici (alta salinità, 35 mM di NaCl).
Isolamento, caratterizzazione e saggi in vitro
Gli isolamenti sono stati effettuati su tre cultivar di fragole (Monterey, Darselect e Elsanta). Le piante sono state coltivate in vasi di plastica da 12 l, riempiti con un terreno di muschio di torba di sfagno biondo commerciale (pH 5,2–5,8); (Vigorplant s.r.l, Lodi, Italia). Ogni vaso conteneva 6 piante, a circa 16 cm di distanza l’una dall’altra. I vasi sono stati mantenuti a 1,2 m dal suolo sotto un tunnel impermeabile (situato in campo presso la stazione sperimentale di Pergine Valsugana. I batteri sono stati isolati da fiori-frutti, foglie, steli, radici, terreno rizosferico e suolo sfuso che sono stati campionati alla fine del ciclo produttivo. I ceppi isolati sono stati purificati e identificati tramite analisi molecolari (sequenziamento del rRNA 16S). Tutti i ceppi non patogenici sono quindi stati caratterizzati per la produzione di IAA, acetoina, ammonio e siderofori. Inoltre, è stata quantificata la loro abilità di ACC-deaminasi e, infine, la capacità di inibire, in piastra, la crescita di X. fragariae.
Effetto in pianta in condizioni di stress salino
Le piante di fragola sono state singolarmente trattate applicando alle radici sette diversi biostimolanti microbici, in condizioni normali o di stress salino. I ceppi utilizzati per l’inoculazione delle radici sono stati P. fluorescens d17, P. jessenei e39, P. agglomerans d15, P. siliensis d26, P. putida d27, P. fluorescens e12 e A. rubi m39. In condizioni non stressate, P. jessenei e39 è stato in grado di aumentare tutti i parametri biometrici fino al 120% rispetto alle piante di controllo. Per quel che riguarda la produttività delle piante, espressa come numero cumulativo di frutti, solo A. rubi m39 è risultato in suo aumento. In condizioni di stress salino, A. rubi m39 è stato in grado di aumentare tutti i parametri biometrici tranne il peso fresco di foglie e radici e, in particolare, la produttività della pianta è aumentata del 110%. Tuttavia, nessuno di questi aumenti è stato statisticamente significativo. Anche P. putida d27 e P. fluorescens e12 hanno aumentato la produttività delle piante, sebbene non significativamente, del 33% e del 100%, rispettivamente.
Effetto protettivo contro X. fragariae
Per testare l’effetto di promozione della crescita e di protezione contro i X. fragariae, le piante di fragola sono state singolarmente trattate tramite applicazione fogliare con un singolo prodotto microbico. Le piante sono state successivamente inoculate, in condizioni controllate, con il patogeno. I ceppi utilizzati per l’applicazione delle foglie erano Brevibacillus brevis d3, Massilia sp. e10, Agrobacterium rubi m39, Rhizobium soli m35, Pseudomonas fluorescens m27, Stenotrophomonas rhizophila m23, Bacillus pumilus m2, Rhodococcus sp. m38 e Vagococcus sp. m40. Nelle piante sane, Rhodococcus sp. m38 ha avuto l’effetto positivo più pronunciato, aumentando significativamente il peso fresco delle foglie e dell’intera pianta e l’altezza della pianta; tuttavia, la promozione della crescita vegetativa ha ridotto leggermente la produzione di fiori/frutti. B. pumilus m2 e B. brevis d3 hanno aumentato significativamente la lunghezza delle radici e quest’ultima ha avuto anche un effetto positivo sul peso fresco delle foglie. S. rhizophila m23 e Massilia spp. e10 sono stati gli unici due ceppi in grado di aumentare significativamente la produttività della pianta; tuttavia, questo risultato è stato ottenuto a scapito della riduzione della crescita vegetativa, che è stata significativa nel caso del peso secco delle foglie nelle piante trattate con S. rhizophila m23. In piante infettate con X. fragariae, S. rhizophila m23 è stato in grado di aumentare il peso fresco e l’altezza della pianta, ma ha ridotto leggermente la produttività della pianta, mentre P. fluorescens m27 ha avuto effetti simili, ma ha anche portato a un sostanziale aumento della produzione di fiori/frutti, sebbene non statisticamente significativo.
Tutti gli altri batteri hanno ridotto significativamente il peso fresco della pianta, ad eccezione di A. rubi m39. È interessante notare che la streptomicina ha anche esercitato un effetto inibitorio sulla crescita, deprimendo il peso fresco della pianta e, in una certa misura, la produzione di fiori/frutti. Durante l’esperimento, è stata inoltre monitorata la progressione dei sintomi della malattia nel tempo. R. soli m35 e P. fluorescens m27 hanno ridotto sia lo sviluppo dei sintomi, sia l’incidenza della malattia alla fine dell’esperimento in misura maggiore rispetto al controllo positivo (streptomicina). L’applicazione di P. fluorescens m27 ha ridotto l’incidenza della malattia al 20%, ma allo stesso tempo ha aumentato la produttività della pianta (+700%) e l’altezza (+21%). B. pumilus m2, S. rhizophila m23 e Rhodococcus sp. m38 ha mostrato un’incidenza di malattia pari a quella dell’antibiotico commerciale streptomicina, mentre A. rubi m39 e Massilia spp. e10 non ha protetto le fragole dall’infezione, mostrando uno sviluppo dei sintomi ancora più rapido nel tempo e una maggiore incidenza rispetto alle piante non trattate. Infine, né l’applicazione alle radici, né quella alle foglie ha prodotto significativi cambiamenti nella qualità dei frutti (peso, grado zuccherino, durezza e colore).
Verso nuovi prodotti microbici
Questo studio ha fornito indicazioni utili per lo sviluppo di nuovi prodotti microbici per mitigare, in fragola, gli effetti negativi dello stress salino o dell’infezione da X. fragariae. I diversi ceppi microbici si sono rivelati capaci di svolgere un effetto molto positivo anche in piante non soggette a stress. L’utilizzo di microrganismi nativi della fragola per l’applicazione nello stesso organo hanno portato ai risultati migliori. Il ceppo P. fluorescens m27 risultato un candidato promettente per lo sviluppo commerciale, in quanto si traduce in molteplici effetti benefici, tra cui il controllo biologico di X. fragariae e l’aumento della produttività delle piante che è risultata fino a 7 volte maggiore rispetto al controllo.
Il vantaggio principale di un prodotto con attività sia PGP che BCA risiede nel fatto che, anche se applicato su un frutteto con una distribuzione irregolare della malattia o quando il rischio di malattia è basso, può comunque fornire funzioni benefiche per piante sane. Inoltre, questo lavoro apre la strada a nuove ricerche sulla bioinoculazione coordinata di batteri nativi di organi e specie che potrebbero rappresentare una nuova strategia per superare i limiti dell’inoculazione PGPB singola. Alcuni ceppi, come P. jessenei e39 e S. rhizophila m23, hanno sostanzialmente incrementato la crescita delle piante, ma non la produttiva. Questi ceppi potrebbero trovare un utilizzo in vivaio per la produzione di nuove piante da stolone o per la formazione delle piante prima della vendita e messa a dimora in campo. L’incompleta efficacia di alcuni prodotti, o la variabilità nei risultati, potrebbero essere imputabile alla necessità di ottimizzare la formulazione con l’aggiunta di appropriati coformulanti, quali bagnanti, osmoprotottori o micronutrienti. Futuri esperimenti mireranno all’ottimizzazione del modo di applicazione, al dosaggio e alle tempistiche, al fine di migliorare l’efficacia e la loro la persistenza.
